Trong khi tuyển diễn viên cho Glee, Murphy muốn tìm kiếm một nam diễn viên thể hiện được tâm huyết của nhân vật. Thay vì tổ chức một buổi tuyển diễn viên, ông lại dành ba tháng theo dõi tại Broadway và tìm được Matthew Morrison, người xuất hiện trong vở kịch Hairspray và The Light in the Piazza; Lea Michele, người xuất hiện trong Spring Awakening; và Jenna Ushkowitz, người xuất hiện trong phiên bản mới của vở kịch The King and I.[12]

Anh đồng thời cũng tuyển chọn những nam diễn viên dù không có kinh nghiệm như có thể hát, nhảy và diễn tốt. Chris Colfer cũng vậy, nhưng Murphy đã viết một nhân vật nữa trong bộ phim để dành cho anh.[12] Jayma Mays cũng đã tham gia buổi tuyển chọn với ca khúc "Touch-a, Touch-a, Touch-a, Touch Me" trong The Rocky Horror Show. Trong khi đó, Cory Monteith chỉ gửi cho họ một cuốn phim mà anh diễn xuất, nhưng chỉ trong vòng vài giây, anh đã nhận được một đề nghị gửi một đoạn băng thể hiện tài năng trình diễn của mình. Trong đoạn băng ấy, anh đã hát "phiên bản tầm thường của video ca nhạc thập niên 80" "Can't Fight This Feeling" do REO Speedwagon trình bày.[12] Kevin McHale đến từ một nhóm nhạc bè nam, họ từng là một phần của ban nhạc Not Like Them. Anh giải thích về sự đa dạng về thể loại của nhóm nhạc cũng như tính nhạc trong bộ phim: "Đó chính là sự hòa trộn giữa nhiều thể loại khác nhau: rock cổ điển, những thứ hiện đại, R&B. Kể cả những bản nhạc kịch cũng được tái dựng. Và bạn sẽ không bao giờ nhận ra nó."[12] Jane Lynch ban đầu chỉ định nhận một vai phụ trong bộ phim,[13] nhưng sau đó đã trở thành vai chính khi tập phim mở đầu của Damon Wayans cho kênh ABC.[14] Sau đó, dàn diễn viên của bộ phim đã ký hợp đồng để xuất hiện trong ba bộ phim điện ảnh của Glee[15] với điều khoản là "[Diễn viên] phải thực hiện ba bộ phim điện ảnh độc quyền cho kênh Fox, [diễn viên] không thể thay đổi hợp đồng sau khi đã ký."[16] Murphy cho biết vào tháng 12 năm 2010 rằng ông không hứng thú với việc làm một bộ phim điện ảnh Glee do "cốt truyện" rồi nói thêm rằng, "Tôi có thể làm nó đại loại như một buổi hòa nhạc sống vậy."[17] Glee: The 3D Concert Movie - được ghi hình trong chuyến lưu diễn Glee Live! In Concert! - công chiếu vào ngày 12 tháng 8 năm 2011.[18]

Glee gồm 12 diễn viên chính. Morrison thủ vai Will Schuester, thầy giáo Tây Ban Nha của trường McKinley High và là người sáng lập đội hát của trường với hi vọng có thể giúp nhóm trở nên thành công như những ngày tháng từng hoạt động.[19] Lynch thủ vai Sue Sylvester, huấn luyện viên của đội cổ vũ "Cheerios" và luôn tìm cách để phá hoại đội hát.[14] Mays thủ vai Emma Pillsbury, là một giáo viên tâm lý bị hội chứng mysophobia (ám ảnh dơ bẩn) nhưng lại có tình cảm với Will,[20] và Jessalyn Gilsig thủ vai Terri Schuester, vợ cũ của Will, người đã bị Will ly hôn vì cô đã giả vờ mang bầu.[21] Lea Michele thủ vai Rachel Berry, một ngôi sao tài năng của đội nhưng bị nhóm cổ vũ và đội bóng bầu dục bắt nạt.[21] Monteith thủ vai Finn Hudson, ngôi sao tiền đạo của đội bóng bầu dục và là người bị bạn bè trêu chọc từ khi tham gia vào đội hát.[21] Trong nhóm còn có Amber Riley trong vai Mercedes Jones, một diva da màu thời trang người thường xuyên phải đảm nhiệm vai trò hát bè; Colfer trong vai Kurt Hummel—một anh chàng đồng tính với kiểu giọng countertenor;[22] McHale trong vai Artie Abrams, một chàng trai thường xuyên chơi guitar và bị liệt ở chân; và Ushkowitz trong vai Tina Cohen-Chang, một học sinh người Mỹ gốc Á và có khả năng giả tật nói. Mark Salling trong vai Noah "Puck" Puckerman, một người bạn thân của Finn trong đội bóng và là người đầu tiên phát hiện ra cậu tham gia đội hát. Nhưng sau đó, cậu cũng đã tự nguyện tham gia vào đội. Dianna Agron trong vai Quinn Fabray, đội trưởng của đội cổ vũ và là bạn gái của Finn, người sau đó cũng đã gia nhập vào đội hát. Naya Rivera và Heather Morris trong vai Santana Lopez và Brittany Pierce, họ đều là thành viên của đội hát và đội cổ vũ. Trong mùa một, họ đã được chọn làm hai diễn viên phụ, cho đến mùa hai, hai người đều xuất hiện trong danh sách những diễn viên chính của bộ phim.[23] Mike O'Malley, người thủ vai cha của Kurt Burt Hummel, đồng thời cũng là nhân vật chính vào mùa hai.[24] Gilsig và O'Malley không còn xuất hiện trong danh sách những diễn viên chính ở đầu mùa ba, dù cho O'Malley là nhân vật khách mời định kỳ trong ít nhất 6 tập của mùa.[25] Có hai diễn viên đã được đẩy lên hàng diễn viên chính của loạt phim trong mùa ba: Harry Shum Jr. trong vai cầu thủ bóng đá kiêm thành viên câu lạc bộ glee, Mike Chang và Darren Criss trong vai những người hay hát líu của Học viện Dalton kiêm thành viên của câu lạc bộ mới Blaine Anderson. Tất cả các diễn viên đều đóng chính, Shum trong mùa đầu và Criss trong mùa hai.[26] Ở mùa ba, Chord Overstreet – người từng bắt đầu làm nhân vật chính trong mùa hai và hóa thân vào vai thành viên câu lạc bộ glee Sam Evans – đã được đẩy lên dàn diễn chính, trong khi Agron và Mays được ghi danh là những diễn viên khách mời định kỳ.[27]

Nhiều nhân vật nguyên gốc đã tốt nghiệp trường McKinley High ở cuối mùa 3. Murphy cho biết, "Chúng tôi không muốn làm một chương trình mà học sinh trung học ở lại trong 8 năm trời. Chúng tôi thực sự muốn trải nghiệm đó phải thật chính xác."[28] Các nhân vật trưởng thành do Matthew Morrison và Jane Lynch thủ vai sẽ vẫn tiếp tục đồng hành cùng loạt phim,[29] dù theo Falchuk, một số học viên—cụ thể là Rachel, Finn và Kurt—nhiều khả năng vẫn góp mặt trên show sau khi họ tốt nghiệp.[30] Tháng 5 năm 2012, Murphy nói rằng chỉ vì chi tiết một nhân vật trong chương trình tốt nghiệp trung học không đồng nghĩa với việc rời trường, "Rất nhiều người viết rằng đã loại Dianna và Amber khỏi show — nhưng họ không hề chia tay show. Tôi nghĩ Amber từng giãi bày về cảm xúc lẫn lộn đó: 'Tôi sẽ không bao giờ ở trong phòng hợp xướng với nhóm người đó nữa.' Ít nhất đó là những gì cô ấy nói với tôi... Khi tôi đọc câu [tweet] đó, tôi liền đính chính "Tôi nghĩ mọi người hiểu sai chuyện rồi." Cô ấy hào hứng với việc nhân vật của mình sẽ tiến triển ra sao. Tôi muốn làm điều đúng đắn cho tất cả bọn họ." Ông tiếp lời: "Tất cả họ đều quay lại. Bất cứ ai là nhân tố đóng chính đang trở lại. Mọi người đều đồng ý."[31]

Ngày 28 tháng 6 năm 2013, truyền thông đưa tin rằng Morris, Riley, Salling và Shum sẽ chuyển từ vị trí đóng chính sang vai trò diễn khách mời ở mùa năm. Vào ngày kế tiếp, Jacob Artist, Melissa Benoist, Blake Jenner, Alex Newell và Becca Tobin (lần lượt thủ vai Jake Puckerman, Marley Rose, Ryder Lynn, Wade "Unique" Adams và Kitty Wilde) đều được tuyển thẳng lên dàn diễn viên chính của show.[32] Ngày 13 tháng 7 năm 2013, Cory Monteith bị phát hiện tử vong tại căn phòng riêng thuộc khách sạn Fairmont Pacific Rim, tọa lạc ở Vancouver, British Columbia. Đội ngũ nhân viên đã được cử tới phòng của nam diễn viên, cũng là nơi thi thể của anh bị phát hiện. Khâu khám nghiệm tử thi kết thúc vào ngày 15 tháng 7 chỉ ra rằng Cory đã qua đời do say rượu và quá liều opioid.[33][34] Ngày 20 tháng 7 năm 2013, Ryan Murphy phát ngôn trên nhiều phương tiện truyền thông rằng Cory sẽ có một màn tri ân trong tập 3 của mùa năm, qua đó xử lý luôn cái chết của nhân vật Finn mà Monteith đóng.[35] Ngày 30 tháng 7 năm 2013, Mays xác nhận rằng cô sẽ chia tay show sau mùa năm để bắt tay vào các dự án khác, nhưng cho hay cô sẵn sàng tái xuất với tư cách diễn viên khách mời trong tương lai.[36] Ngày 7 tháng 7 năm 2014, có tin xác nhận rằng Rivera sẽ hiện diện ở vị trí diễn chính cho mùa sáu, theo như đề xuất từ cô.[37] Ngày 28 tháng 8, một website tiết lộ rằng Amber Rile sẽ một lần nữa sẽ đóng cặp thường xuyên với Dot-Marie Jones, còn Jayma Mays cũng nằm trong vị trí diễn chính.[38]